產(chǎn)品參數(shù)： 中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品貨號(hào) | Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒 | Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit | 50次 | BJ-01X6356 |
商品詳細(xì)介紹： 本試劑盒是一種采用Annexin-PE與7-AAD雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。 細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。7-AAD是一種核酸染料，可進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色。7-ADD與PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，因此通常將Annexin V-PE與ADD配合染色，以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。 操作步驟： 1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： a．對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。 b．對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。 2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去離子水)。 3、用250μl Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml。 4、取 100μl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-PE 和 10μl 7-AAD 溶液。 5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。 6、在反應(yīng)管中加400μl PBS，流式細(xì)胞儀(FACS)分析。 Jurkat細(xì)胞用誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-PE/7AAD雙染流式分析圖譜 儲(chǔ)存條件：2～8℃，避光保存 |
實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 一、分離與培養(yǎng)： 1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??； 2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置； 3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化； 4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)； 二、免疫熒光鑒定： 1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min； 2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min； 4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜； 5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h； 6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。 培養(yǎng)操作步驟 ： 1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）； 3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)； 4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中； 5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。
 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明： 1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法； 2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過(guò)鉻酸洗液處理； 3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕； 4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過(guò)大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率； 5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。 操作要點(diǎn)： 1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。 2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。 3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。 4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。 5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 Radix isatidisLAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Hepatitis B Virus(HBV)乙型肝炎病毒H型探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Phialophora malorum蘋果邊腐病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Moraxella catarrhalis卡他莫拉探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Bulbus fritillariae cirrhosae川貝母LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1)人免疫缺陷病毒I型通用探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Providencia stuarti斯氏普羅威登斯探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Peronosclerospora spp.玉米霜霉病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 甲型流感/乙型流感雙重染料法熒光定量PCR試劑盒 定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Agkistrodon蘄蛇染料法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Human Herpesvirus-8(HHV-8)人皰疹病毒8型LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Ramulus mori桑枝探針?lè)≒CR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒組織PKCζ激活性定量檢測(cè)試劑盒（A/B/C） 20次 細(xì)糖酵解溴百里藍(lán)（BTB）檢測(cè)試劑盒 20次 冰凍切片組織P27蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測(cè)試劑盒 10/20次 [γ32P]ATP激標(biāo)記試劑盒 20次 脂質(zhì)過(guò)氧化物異構(gòu)前列腺素（ISOPROSTANE）ELISA定量測(cè)定試劑盒 48/96次 電子顯微鏡制片處理試劑專題 組織二酯1（PDE1）活性連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測(cè)試劑盒 10次 細(xì)胞/組織線粒體DNA萃取試劑盒 10次 組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DDPH）定量檢測(cè)試劑盒 50次 細(xì)胞內(nèi)核酸氧化8-氧鳥(niǎo)苷（8-oxo-G）流式細(xì)胞分析試劑盒 10次 細(xì)胞銅離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒 20次
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