細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)

英文名稱：T56-LIMKi

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8521

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

大鼠 IL27 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  10次

大鼠 IL21 基因全長ORF克?。⊿CHMORL）間接染色試劑盒  

大鼠 IL8RB 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  50次

大鼠 IL4R 基因全長ORF克?。⊿CHMORL）直接染色試劑盒  

大鼠 IL2RG 基因全長ORF克隆細(xì)胞衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL1R2 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL25 基因全長ORF克隆全組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

大鼠 IL19 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 TNFRSF18 基因全長ORF克隆冰凍切片組織衰老晚期特異性脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL18R1 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL17RA 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)MYCBP2  MYC結(jié)合蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2ml

PNPT1  多核苷酸磷酸化蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

FOXO3A  叉蛋白O3A抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-MAX protein(Tyr123)  磷酸化Myc基因相關(guān)X因子抗體 規(guī)格: 0.1ml

PDHB  丙酮酸脫E1β亞單位抗體 規(guī)格: 0.2ml

C12ORF61  12號染色體開放閱讀框61抗體 規(guī)格: 0.2mlM2-PK/PKM2  小鼠抗丙酮酸激-M2抗體 規(guī)格: 0.1ml

Histone H3 (Di Methyl K27)  三甲基化組蛋白H3抗體 規(guī)格: 0.1ml

SMAD9  SMAD家族9抗體 規(guī)格: 0.2ml

AP2M1/AP-2?  接相關(guān)蛋白復(fù)合體AP-2μ鏈1抗體 規(guī)格: 0.2mlGTSE-1  G2期/S期應(yīng)答相關(guān)蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-Guinea pig IgG/Bio  標(biāo)記的小鼠抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

RAB40B  RAS基因家族蛋白RAB40B抗體 規(guī)格: 0.2ml

CRMP4/DRP3  腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白4抗體 規(guī)格: 0.2ml