操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：CDK4/FLT3雙重抑制劑（AMG 925）

英文名稱：AMG 925

產(chǎn)品規(guī)格：5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8130

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

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CDK4/FLT3雙重抑制劑（AMG 925）5-HT2C受體激動劑(Lorcaserin)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Lorcaserin豬膽粉  250g

SGK1抑制劑（EMD638683 S-Form）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  EMD638683 S-Form1瓶 Sp2/0-Ag14細胞株 Sp2/0-Ag14 低溫運輸和保存

糖復合體分解抑制劑(Miglitol)  1mL(10mM)|1g|5g  Miglitol尿素瓊脂（PH7.2） Urease Agar Base 250g

DPP-4抑制劑（Teneligliptin hydrobromide）  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg|250mg  Teneligliptin hydrobromide10L DMEM( 高糖 ) DMEM(High Glucose) 4℃保存

α-葡萄糖苷酶抑制劑(Voglibose)  1mL(10mM)|50mg|100mg  Voglibose5次 大提柱式DNA清除劑 Maxi Column DNA Erasol 溶液A需4℃保存，其余可以室溫保存

5-HT3激動劑（Pumosetrag Hydrochloride）  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  Pumosetrag Hydrochloride1g 2,3,5 氯化三苯基四氮唑 2，3，5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride(TTC) 室溫干燥避光保存

SERCA激活劑（CDN1163）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  CDN116350T 豬鏈球菌Ⅱ型PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

生長素釋放肽合成激動劑(GHRP-2 metabolite 1)  1mg|5mg|10mg|25mg  GHRP-2 metabolite 1200次  ATP檢測試劑盒 Oxidative Stress Detection Kit 常溫保存

11βHSD1抑制劑(PF-915275)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  PF-915275100mL Kinase Storage Buffer   Kinase Storage Buffer   常溫保存

GLP-1受體激動劑(Taspoglutide)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg  Taspoglutide50次 兩管式RT-PCR試劑盒(MMLV-Taq) Two-Tube RT PCR Kit -20℃保存

proton pump抑制劑(Bamaquimast)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Bamaquimast2 ug pLVTHM pLVTHM 低溫運輸，-20℃保存