培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細(xì)介紹：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

人 MYBL2 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子緊密連接蛋白1(ZO1)免疫試劑盒*直銷

人 FERMT2 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子金屬硫蛋白2(MT-2)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 NEDD1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 THOC1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子窖蛋白Caveolin-1(CAV1)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 SHC4 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子膠原II(Collagenase II)免疫試劑盒*直銷

人 ETFDH 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子膠原I(Collagenase I)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 TMIGD1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子降鈣素(CT)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 VWC2L 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 QRFP 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子甲狀腺素(T4)免疫試劑盒*直銷

人 OSTN 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子基質(zhì)金屬蛋白抑制因子1(TIMP-1)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 IDH2 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子基質(zhì)金屬蛋白9(MMP-9)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

PI3K alpha抑制劑（CNX-1351）微管(tubulin)聚合抑制劑(Auristatin PE)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg  Auristatin PE敏感紙片 Penicillin-sensitive paper 20片

REV-ERBα/β激動(dòng)劑（SR9011 hydrochloride）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  SR9011 hydrochloride1瓶 JK(Jurkat)細(xì)胞株 JK(Jurkat) 低溫運(yùn)輸和保存

UBA5抑制劑(DKM 2-93)  1mL(10mM)|50mg|100mg|200mg|500mg  DKM 2-93350ml厭氧培養(yǎng)袋  10個(gè)/包

FAP抑制劑(SP-13786)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  SP-13786100µg Tth RecA 蛋白 Tth RecA  -20℃保存

TRK家族受體抑制劑（LOXO-101 sulfate）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  LOXO-101 sulfate500mL Sodium Phosphate Buffer（鈉緩沖液）,0.2M,pH8.5  Sodium Phosphate Buffer,0.2M,pH8.5  常溫保存

微小RNA-96抑制劑(MIR96-IN-1)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  MIR96-IN-1150U T4 RNA 連接 2 （雙鏈RNA連接 ） T4 RNA Ligase 2 -20℃保存

TAK1抑制劑(Takinib)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Takinib2 ug psiCHECK-2 psiCHECK-2 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

BET/BRD4溴結(jié)構(gòu)域抑制劑（AZD5153 6-Hydroxy-2-naphthoic acid）  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  AZD5153 6-Hydroxy-2-naphthoic acid50次 一管式病毒RNAout One-Tube Viral RNAOUT 4℃保存

IDO-1抑制劑(PF-06840003)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  PF-068400032 ug pCMV-AD pCMV-AD 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

PI3Kδ抑制劑（GSK2269557 free base）  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  GSK2269557 free base彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基  

Bcr-Abl WT和Bcr-Abl T315I抑制劑(GNF-7)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  GNF-7250g 聚乙二醇 3350 PEG 3350 室溫陰涼干燥保存