細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：鞘氨醇激酶(SK)抑制劑(SKI II)

英文名稱：SKI II

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg|200mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7903

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

人 CLCA2 基因全長ORF克隆小鼠血栓前體蛋白(TpP)免疫試劑盒*直銷

人 GGT6 基因全長ORF克隆小鼠血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)免疫試劑盒進口、組裝

人 DCTN1 基因全長ORF克隆小鼠血漿激肽釋放(KLKB1)免疫試劑盒進口、分裝

人 NPBWR2 基因全長ORF克隆小鼠血紅素氧合2(HO-2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應

人 MAB21L2 基因全長ORF克隆小鼠血紅素氧合1(HO-1)免疫試劑盒*直銷

人 AGMAT 基因全長ORF克隆小鼠血管性血友病因子/瑞斯托輔因子(vWF)免疫試劑盒進口、組裝

人 GSR 基因全長ORF克隆小鼠激肽(BK)免疫試劑盒進口、分裝

人 ATG4D 基因全長ORF克隆小鼠血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應

人 EIF3M 基因全長ORF克隆小鼠血管生成素4(ANG-4)免疫試劑盒*直銷

人 EXO5 基因全長ORF克隆小鼠血管生成素2(ANG-2)免疫試劑盒進口、組裝

人 ALDOA 基因全長ORF克隆小鼠血管生成素1(ANG-1)免疫試劑盒進口、分裝

鞘氨醇激酶(SK)抑制劑(SKI II)G9a和GLP抑制劑(UNC0642)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  UNC0642艾格瓊脂 Eugonic Agar 250g

TGF-β receptor type I/II抑制劑(LY2109761)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  LY21097611瓶 PC-3M細胞株 PC-3M 低溫運輸和保存

ATR抑制劑(VE-822)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  VE-822腸球菌瓊脂 Enterococcus Agar 250g

PPARγ激動劑  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Troglitazone5g 氯化銨 T Chloramine T 4℃保存

PKC抑制劑(Go 6983)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Go 698325mL Zymogramm Sample Buffer  Zymogramm Sample Buffer  常溫保存

Ire1抑制劑(STF-083010)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  STF-08301048管 DTT，免稱量蛋白級 Weighting-free DTT -20℃保存

BRAFV600E抑制劑(PLX8394)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  PLX8394FB2增菌液 FB2 Enrichment Broth 10ml*20支/包

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300抑制劑(C646)  1mL(10mM)|10mg|50mg  histone acetyltransferase p300 inhibitor50次 木材DNAout  

tubulin抑制劑(Mertansine)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  Mertansine2 ug pENTR4-FLAG pENTR4-FLAG 低溫運輸，-20℃保存

FGFR1抑制劑(PD173074)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  PD173074含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE） Trypticase Soy-Yeast Extract Broth 250g

survivin抑制劑(YM-155)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  YM-15520Ku 脲 ( 尿素 巨豆 ) Urease(Jack Bean) 4℃保存