細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：KLF5抑制劑(ML264)

英文名稱：ML264

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8545

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 ADRB2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽血液超氧化物陰離子化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 AGTR1 / AT1 轉(zhuǎn)錄變體1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽體液超氧化物陰離子化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 SHH / Sonic Hedgehog 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶HA標(biāo)簽細(xì)胞超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 ITGA6 轉(zhuǎn)錄變體2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽組織超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 Galectin-8 轉(zhuǎn)錄變體1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽血液超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 PCSK1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽體液超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 TGFBR1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽體內(nèi)（in vivo）超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 E-Cadherin 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶Myc標(biāo)簽酵母超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 EREG 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽植物超氧化物陰離子熒光法定量檢測(cè)試劑盒  20次

人 TGFA 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽甲萘醌溶液（1毫摩爾）  50毫升

小鼠 CD16-2 / FCGFR4 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽過(guò)氧亞硝基陰離子解構(gòu)劑FeTMPyP pentachloride  1毫升/1毫摩爾

KLF5抑制劑(ML264)SECTM1  分泌和跨膜蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Rabbit Anti-dog IgG/Cy7  Cy7標(biāo)記的兔抗狗IgG 規(guī)格: 0.1mlVAMP-1/Synaptobrevin-1  VAMP1囊泡相關(guān)膜蛋白1抗體 規(guī)格: 0.1ml

Plectin  網(wǎng)蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

SVH/ARMC10  肝蛋白剪接變異體蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Rabbit Anti-Guinea pig IgG/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1mlproCNP/NPPC  促尿鈉排泄肽前體C抗體 規(guī)格: 0.1ml

Rabbit Anti-Guinea pig IgG/PE  PE標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

PDZD8  PDZ結(jié)構(gòu)域PDZK8蛋白抗體 規(guī)格: 0.2mlNCK2/Nck beta  NCK銜接蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2ml

ARHGAP24  Rho GTP激活蛋白24抗體 規(guī)格: 0.2ml

MCSF/M-CSF  巨噬細(xì)胞克隆刺激因子抗體 規(guī)格: 0.1ml

NAT10  乙?；D(zhuǎn)移10抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-Alpha synuclein(Ser129)  磷酸化核突觸蛋白α抗體 規(guī)格: 0.1ml

Rabbit Anti-rat IgM/Alexa Fluor 488  Alexa Fluor 488標(biāo)記的兔抗大鼠IgM 規(guī)格: 0.1ml