儲存條件: 僅用于科研14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法 1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。 2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。 3. 細(xì)胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。 4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。 5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 產(chǎn)品名稱 | 胡蘿卜源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | | 貨號 | BJ-R7397 |
產(chǎn)品特點: 1. 胡蘿卜源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒使用化學(xué)修飾的熱啟動聚合酶,反應(yīng)特異性高,*程度地避免了非特異擴增; 2. 反應(yīng)緩沖液經(jīng)充分優(yōu)化,反應(yīng)靈敏快速,40個循環(huán)只需20多分鐘; 3. 抗干擾能力強,反應(yīng)重復(fù)性高,適合對土壤、糞便、腫瘤和血液來源的復(fù)雜樣本中的靶基因進行檢測分析。 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。 特異性熒光標(biāo)記: TaqMan法 TaqMan探針的特性: (1)5′端標(biāo)記有報告基團(Reporter, R),如FAM、VIC等 (2)3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) (3)探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ,無熒光, R與Q分開,發(fā)熒光 (4)Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針 相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量: 內(nèi)標(biāo)(Endogenous Control)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因,在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中定,受環(huán)境因素影響小,內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量。 檢測步驟: 一、 試劑的準(zhǔn)備 從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振蕩混勻后,10000rpm離心10s。 設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照),每個測試反應(yīng)體系配制如下表: 試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量 熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL 酶混合物 1 µL N×1 µL 總量 15 µL N×15µL (1) 計算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中,充分混勻,10000rpm離心10s,向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液,向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬時離心10秒。 7.2 qPCR反應(yīng)條件 將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。 推薦循環(huán)條件: 1循環(huán) 50℃ for 2 min 預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec 在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團:設(shè)置為FAM。淬滅基團:NONE,請勿選擇ROX參比熒光。
實驗方法步驟: 方法 1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。 2:調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保溫7min。 3:結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。 4:PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。 PCR實驗步驟 典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán),通過多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是: 將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈; 人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合,兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短; 耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因為模板從5’→3’方向延伸,合成DNA的新互補鏈。 以下是公司正在熱銷的產(chǎn)品: 2,1,3-并硒二唑分子式:英文名稱:2,1,3- benzene and selenium two:273-15-4分子量: C6H4N2Se 骨碎補提取物英文名稱:Drynaria extract分子式:分子量:: 偶氮胂II英文名稱:Arsenazo II分子式:分子量: C32H20As2N4Na4O2:3861-75-4 硫長春新堿英文名稱:Vincristine sulfate分子式:923.04分子量:C46H56N4O10·H2:2068-78-2 氧苦參堿英文名稱:Oxidation of Matrine分子式:264.36326分子量:C15H24N2O2:16837-52-8 N-反式-肉桂酸咪唑分子式:198.22英文名稱:N- trans - cinnamic acid imidazole:1138-15-4分子量: C12H10N2O 2-氯-4-硝咪唑分子式:147.52英文名稱:2- -4- nitro group:57531-37-0分子量: C3H2ClN3O2 2,3,6,7,10,11-六溴三亞分子式:701.67英文名稱:2,3,6,7,10,11- six Sanya benzene:82632-80-2分子量: C18H6Br6 丁二酸二酰分子式:146.15英文名稱:Butyl succinate two:4146-43-4分子量: C4H10N4O2 性藍(lán)BGA英文名稱:Acid blue BGA分子式:分子量:: 烏索英文名稱:Ursolic acid分子式:456.7分子量:C30H48O3:77-52-1 胡蘿卜源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒大鼠腎足突細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL 人直結(jié)腸平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基大豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium japonicum BRL(大鼠肝細(xì)胞)5×106cells/瓶×2 人肺大靜脈平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL 爪哇霉 Rhizopus javanicus大鼠小腸平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(未分)英文名稱:PC-12(未分) 糖原合酶激酶3α(GSK3α)重組蛋白英文名稱:Recombinant Glycogen Synthase Kinase 3 Alpha (GSK3a) 乙酰輔酶A羧化酶α(ACACα)重組蛋白英文名稱:Recombinant Acetyl Coenzyme A Carboxylase Alpha (ACACa) 蘇云金芽胞桿菌亞毒亞種 Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus瘤菌 Rhizobium sp. 整合素α6(ITGα6)重組蛋白英文名稱:Recombinant Integrin Alpha 6 (ITGa6) 大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基苜蓿中華瘤菌 Sinorhizobium meliloti |