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聯(lián)系我們PCR步驟及循環(huán)參數(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：2977 更新時(shí)間：2021-10-08
PCR步驟：1. DNA變性
(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
2. 退火
(25℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
3. 延伸
(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈
PCR的循環(huán)參數(shù)：
1. 預(yù)變性(Initial denaturation)
模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火(Primer annealing)
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略
延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
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